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能上太空能入丛林,为了DNA测序无处不在,基因测序仪做了哪些创新?

周梦亚 2018-03-25 08:00

Illumina在2018年的摩根大会上推出了一款新的测序仪iSeq100。这是Illumina已经发布的最小的测序仪,占地仅1平方英尺,在美国地区标价为19900美元。


相比此前发布的测序仪,这一款测序仪无论是在产品设计还是价值制定上,都将小型实验室设为零标的对象。因此,Illumina此举在某种从程度上是想通过小型、低成本的仪器打开这一部分实验室的大门。

 

但说到小型化测序仪,最经典的还要数Oxford Nanopore的MinION。MinION被称为口袋测序仪,只有4英寸长,大约普通U盘大小,由一个传感器芯片,专用集成电路和一个完整的单分子感应测试所需的流控系统构成。相比目前主流的“洗衣机”测序仪,MinION显得独树一帜,也更具灵活性。

 

MinION最初的定位是让测序无处不在,Oxford Nanopore希望MinION能够渠道大型测序仪去不到的地方,比如丛林、海上、甚至是太空。

 

上天


首先我们设想一下太空中的场景。在国际空间站内,宇航员将以每小时17000英里的速度围绕地球公转,他们每天要经历15次日出和日落。在太空中可以体验到失重带来的漂浮感,同时可以欣赏到非常震撼的情景,这些都是非常棒的体验。但如果宇航员在太空中生病,那么后果将是难以想象的。

 

国际空间站内没有任何可以明确诊断疾病的设备,更没有办法识别出导致疾病的微生物种类。如果宇航员在太空中生病,他们只能通过向地面的医护人员描述症状来推测疾病。但这样的方式没有办法确定这些疾病是细菌还是病毒或者其他东西引起的。如果能够在太空中破译这些感染源的基因密码,就能识别出这些微生物,并且找到相应的治疗药物。

 

如果是在2014年以前,这样的想法都是很荒谬的。因为当时的测序仪全是些大家伙,至少冰箱或微波炉大小。光是要把这些笨重的仪器带上太空就很费时,更别指望他们在太空中会完好无损(这些物体在太空中会呈悬浮状态)。

 

2014年,随着Oxford Nanopore掌上测序仪MinION的问世,这一切成为可能。MinION足够小,很方便携带,即使在失重的情况下,宇航员也能够很轻易的将其控制住。

 

2016年8月,在微重力条件下对测序仪进行测试后,NASA宇航员Kate Rubins带着MinION进入了国际空间站。项目将事先准备好的老鼠、病毒和细菌的DNA样本带到了国际空间站,由 Rubins在太空中进行检测,地面团队将与之同步测序。

 

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NASA宇航员Kate Rubins首次在太空利用MinION测序仪进行DNA测序

 

试验最后,研究人员将地面与太空的测序结果进行了对比,结果显示两种测序完全匹配。这就意味着,在MinION的帮助下,宇航员可以直接在绕贵飞行过程中进行遗传物质或基因变异的检测。NASA形容此举开启人类在太空活体生物基因测序全新时代。

 

入地


太空中都能测序,在海上和丛林中当然不是什么难事。有人就曾计划带着MinION去坦桑尼亚的热带雨林对青蛙测序,还有人打算带印度洋。但目前而言,MinION最大的价值还是在医疗领域。

 

感染性疾病一直是人类健康的重大威胁,由感染性疾病引起的死亡人数远远超过战争。比如是人类历史上最严重的瘟疫黑死病。公元542年,君士坦丁堡爆发了由鼠疫引起的“黑死病”。这场灾难不仅打破了查士丁尼一世恢复帝国统一的梦想,还几乎让整个东罗马帝国付之一炬。

 

尽管这场可怕的灾难已经过去,但人类至今都没有摆脱感染性疾病的威胁。

 

2015年,历史上最大的埃博拉疫情已经进入了第二年,大约有10000多人死于疫情,感染人数则更多。科学家和卫生工作者在遏制这一流行病方面取得了重大进展,但其中一个关键的因素却一直没有取得突破:埃博拉病毒基因组的秘密。

 

如果能对病毒进行测序,科学家及可以更有效的开发出诊断试剂和疫苗。通过比对来自不同地区和时间线病毒的基因组信息,他们可以确定病毒在传染的过程中是否出现了突变,并以此制定和计划控制措施;通过比对患者身上的病毒基因组,他们可以计算出谁感染了谁,并以此减少传播途径。

 

遗憾的是,在病毒爆发的过程中,只有少数的病毒进行了基因组测序。原因很简单,病毒袭击的大部分是偏远地区。由于交通不便,大型测序仪很难进入,所有待测序样本必须经历漫长的运输过程到有条件的实验室进行分析和检测。

 

生物学家 Nick Loman认为,为什么不能像到别的办法来进行测序呢?很明显,MinION有用武之地。

 

Oxford Nanopore在2014年2月终于发起了 MinION的早期访问计划。Lomani是这起计划签署的数百名科学家之一。科学家只需支付1000美元,就能获得一台MinION 设备和一个启动试剂盒,包括三个流动槽、两个试剂盒、软件以及定期的免费耗材。

 

早期,由于运输和试剂等问题,测序仪的效果并不理想。几位科学家已经放弃使用,但Lomani依然在坚持。

 

2014年,Lomani在伯明翰医院使用升级后的MinION成功完成了对沙门氏菌的测序。2015年4月,他的学生Joshua Quick和另外三名助手带着MinION前往几内亚。

 

由于交通不便,Quick一行人所带的设备也一切从简:三台电脑、一些化学试剂、一台离心机以及一台热循环仪(还是盗用的同实验室同学的)。手提箱打开后就是两张课桌,到达几内亚两天后,他们开始在这个简易的试验台上对埃博拉病毒进行测序。

 

在疫情爆发过程中,MinION完美的证明了自己的价值。传统上,科学家们需要收集数百个养样品再一并寄出,这个过程往往会需要几个礼拜才能收到结果。相反,MinION能够在实地进行测序,省去了大量在路上耗费的时间。

 

6个月后,研究小组完成了142组埃博拉病毒的测序。

 

世界卫生组织在2016年宣布埃博拉疫情结束,但不久后另外的疫情又席卷了美洲地区。Loman团队再次带着MinION出发,他们沿着巴西沿海一路行驶,希望能够揭示更多寨卡病毒的信息。

 

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2016年世界卫生组织宣布埃博拉疫情结束,而另一个对手又来了——寨卡病毒。这是2016年最大的威胁,疫情蔓延到了美洲和太平洋地区。Loman带着MinION再次踏上了旅程。

 

他们驾驶者小型面包车沿着巴西沿海一路行驶,走访了2000多公里的巴西东北部疫情区,对1300多名感染者做了基因检测。

 

在人类、蚊子、和病毒基因组测序之旅中,研究人员从北美洲到巴西,一路边走边测序取样,高强度地使用了多种检测手段:人类和昆虫RNA提取、寨卡病毒RNA-seq和cDNA测序、多方比对确认全基因组测序结果(ThermoFisher)、系统发生分析等等。

 

通过基因组测序了解病毒的基因组成,科学家们追踪到了寨卡在巴西的传播情况。这项研究结果表明,寨卡起源于巴西(拉丁美洲)境内,在美国(北美洲)发现了首例寨卡感染(2016年初)之前,寨卡就已经开始向世界各地蔓延。

 

此次疫情控制中,MinION在越野实地取样中发挥了重大作用。

 

原理


同样是测序仪,为什么Oxford Nanopore就能把测序仪做的这么小?无论是Illumina,Pacbio,还是IonProton都是100斤以上大家伙,Oxford Nanopore是如何把产品做到这么小的?这就需要从MinION的原理说起。

 

与目前主流的测序仪产品不同,MinION是第三代测序仪,它的技术原理叫做纳米孔测序。

 

纳米孔这个名字听起来像一种孔的名字,其实还真是。这是一种微小的钉状蛋白空心管,直径只有几十亿分之一米。

 

纳米孔测序的核心是一种分布着纳米孔的蛋白质合成膜。把蛋白质合成膜被浸泡在导电的溶液中,当合成膜被施以电压是,离子会在电压的作用下流过孔径,形成电流。但如果某些东西(比如DNA链)堵住了孔,离子流动就会受到阻碍,电流则会减弱。

 

DNA分子骨架主要由磷酸和四种碱基(四种碱基分别简称ATCG)组成,DNA测序实际上就是测的这四种碱基的排列顺序。这四种碱基,每一种都能以不同的方式改变纳米孔中的电流趋势。因此,当DNA链条像纸条一样通过纳米孔是,通过测量电流的变化,就能破译一条DNA链的序列。


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这样的测序方式与传统方法有很大的不同。以往的方法中,科学家们必须放大DNA分子以产生非常多的相同拷贝,再将这些拷贝分成小块,逐个排列,最后在把支离破碎的序列组装成一个整体。这就像在读一本书的时候,先把它切碎,分成很多个章节,最后在粘连起来。

 

相比之下,纳米孔测序则能够一次读完一本完好的书。DNA在测序过程中不需要扩增或分裂,并能够长时间的连续测序。也正是如此,纳米孔测序原理的测序仪体积总是比较小。

 

诞生


相传,这个想法最初诞生于1989年,加尼佛尼亚大学的David Deamer在驾车通过5号洲际公路是找到了灵感。后来,他和他的同时花了十几年时间证明可以通过纳米孔捕获到DNA,并以此区分出不同的碱基。Oxford Nanopore几乎也花了同样的时间来研发纳米孔技术的测序仪。

 

牛津纳米孔成立于2005年,当时公司的计划是像其他公司一样,生产大型的测序仪。这款大型测序仪名叫GridION ,大约有1992年的盒式磁带录像机大小。做小型化设备的想法源自公司CTO Clive Brown。当是illumina的测序仪已经在市场上逐渐占据优势,Brown希望能够超越他们。

 

Brown其实跟illumina颇有渊源。在加入Oxford Nanopore前,Brown在Solexa 从事测序仪的研发工作。2006年,Solexa被illumina收购,但公司的决定与Brown的意愿背离。于是,Brown没有像其他同事一样加入illumina,而是辞职进入了Oxford Nanopore。

 

在Solexa 的基础上,illumina又开发出了几款新的测序仪,他们在测序界建立了不可动摇的地位。2009年,这个庞然大物对Oxford Nanopore投资了1800万美元。这笔钱可以帮助Oxford Nanopore将技术商业化,但代价是illumina的CEO要进入Oxford Nanopore的董事会。

 

Illumina那时是以大型仪器为主,Brown希望能够开发出与对方有区分度的产品。

 

MinION第一次对外公开是在2012年2月佛罗里达的一次会议上,当时它还是个概念产品。Brown只用了一页PPT来介绍产品,引起了很大的反响。有的人认为这是个笑话,有的人认为这将给Illumina一记暴击。

 

更重要的是,MinION的对外公开标志着Oxford Nanopore的独立化,公司在2013年正式解除了财务关系。

 

不过正如历史所表明那样,走自己的路从来都不是件容易的事,MinION的诞生也经历坎坷。

 

按照原计划,MinION本应该在2012年年底推出。但由于制造工艺的问题,Oxford Nanopore并没有如期兑现承诺。更糟糕的是,在无限延长的时间里,Oxford Nanopore选择了沉默,这也因此让他们一度失去了业界的信任和支持。许多科学家形容MinION是人间蒸发了,公司在这一轮嘲讽中无法辩驳。

 

发展


在产品面世后,行业也不乏对MinION的质疑声。尽管在灵活性和成本上占据优势,但MinION依然很难在与Illumina这样的顶级对手竞争中取得优势。

 

MinION可以对细菌、病毒这样的小型基因组进行测序。但如果换成植物或者人类的基因组,MinION测序速度就太慢了。人类基因组的量级要比大肠杆菌大一千倍,小麦基因组也是大肠杆菌基因组五倍。

 

另外,MinION的错误率也让人感到积累,早期试验版本的错误率在30%左右;Loman 在对埃博拉病毒测序时,错误率大约有10%。而对手illumina测序仪只有0.1%的错误率。

 

这也驱使Oxford Nanopore对设备的硬件及软件进行升级。MinION前后一共进行了近十次升级,R9版本最低错误率已经能降到2%。

 

2016年12月,牛津大学人类遗传学中心和英国基因分析公司Genomics plc宣布,首次使用MinION完成了多个人类全基因组测序和分析。这次成功打开了大规模使用纳米孔测序技术的大门。

 

不过,即便如此,要真正让测序不受地点限制,Oxford Nanopore必须解决另一问题。即使测序仪能够做到小型化,但测序之前仍然需要样本制备,需要用到离心机、移液管等仪器;测序完成后,需要用到专门的分析软件对获得的“ATCG”序列进行解释。

 

所以,MinION面临了一个非常尴尬的境地,它可以被带到任何地方,但仅有一台MinION却什么事情都干不了。

 

升级配套服务


为此,Oxford Nanopore又开发了两款新产品。

 

Oxford Nanopore在2014年10月推出了另一款测序仪PromethION。当然,他们同样仿造发布MinION发布模式,提前一年多启动了PromethION 访问计划(PromethION Access Programme PAP)为产品造势。

 

相比MinION,PromethION的测序能力更强。其内部含有144000个纳米孔,可以进行多个样本的独立测序。Oxford Nanopore还提出了一个“Run until”的概念。直到获得足够量的数据之前,PromethION可以一直运行。

 

当然,由于满足了更强的性能,PromethION的体积比MinION要稍大一点。PromethION是一款平板式测序仪器,比iPad大一些。

 

但PromethION也没有办法解决样本制备的问题。这个问题就像一根绳子,让Oxford Nanopore一直没有办法彻底实现便携式测序。

 

2015年10月,Oxford Nanopore在伦敦举行了London Calling用户会议。在此次会议上,Brown发布了Oxford Nanopore的新产品。与会者形容这或许会是一次“改变游戏规则的”发布会,就像当年苹果发布iPhone。

 

这款新产品叫做Voltrax,是一种自动化样品制备系统,能将原始的生物样品转化成立即可测序的形式,且过程中无需人工干预。

 

Voltrax是完全自动化的一次性样本制备系统,含有6-12个样本输入口,并且是可编程的。Brown希望该产品能够有效的缩短样本制备的时间,他们的目标是10分钟完成样本制备。

 

外观上,Oxford Nanopore同样赋予了Voltrax便携是的特点,产品大约只有手掌大小。更重要的是,它还能与MinION或PromethION测序仪直接对接。

 

Voltrax的面世标志着Oxford Nanopore完成了从样本制备到测序的产品线布局,当然,更大的意义在于是的MinION和PromethION真正的摆脱了外在条件的束缚,真正意义上实现实时、实地测序。


Oxford Nanopore还在2016年10月发布了概念产品SmidgION。如果说MinION给我们带来的是全新的便携式测序体验,SmidgIon则提出了更新的概念——移动测序仪。SmidgIon比MinION更小,可以通过充电接口和耳机接口与智能手机或其他移动设备连接,非常适用于紧急情况的实时处理和现场分析。


SmidgION插到手机上运行,如果再将后续所需要分析软件开发成APP,测序就可能真的回归到了人人都可用的技术。

 

其他二代测序仪的小型化趋势


Oxford Nanopore是目前唯一有便携式产品产出的企业。但除此之外,我们也可以看到其他从事大型测序仪生产的公司也正在朝着小型化设备的方向前行。

 

从2015年起,市场上主流的几家测序仪生产商均陆续推出了自己的小型化台式设备:

 

2015年9月,ThermoFisher在收购LifeTech后首次拓展了其NGS测序仪产品线,推出了全新的IonS5系列测序仪。IonS5测序仪在几个关键参数上处于IonPGM和IonProton之间,很好地填补了中端产品的空缺。

 

Illumina则在2016年初发布了首个小型测序仪MiniSeq,并且在2018年初又发布了另一款小型测序仪iSeq™ 100(这款测序仪占地近1平方英尺)。

 

华大基因推出的BGISEQ-50,以及华大智造在2017年推出的两款测序仪MGISEQ-2000 及 MGISEQ-200。

 

其中,一些企业或多或少是受到了Oxford Nanopore的影响,但本质原因还是顺应了基因测序涌向中小实验室的潮流。这些小型化设备已经能够满足大部分测序需求,同时又可以提供HiSeq这类面向测序工厂级别的产品所不具有的灵活性。随着基因行业的发展和精准医疗方案的逐渐落地,个性化测序需求会成为全新的市场增长点。

 

尽管这些产品离便携式规格还相差甚远,但想想从26.5m3的ABI prism 310,到如今微波炉大小,不得不让人惊叹。

 

这不仅让人想到了计算机的演化史。1946年第一台计算机诞生的时候,或许谁也想不到这个大家伙最终能缩小到手提大小。或许有一天,测序仪也不再是只能放在实验室的高端仪器。


在测序价格下降到人们普遍可以接受的程度后,人们必将会开始思考如何让测序的场景多元化。


如今,大型项目依然是大型计算机的天下,但在日常应用中随处可见的是小型计算机的身影。不仅如此,便携式的笔记本电脑已经逐渐取代了小型的台式计算机,成为日常生活中不可或缺的娱乐、办公工具。


而在当下看来,测序仪或许不能像计算机一样,成为日常应用的工具。但测序仪的便携式创新,除了让测序场景覆盖到太空、丛林、海洋这些场景以外,其门槛的降低也向对基因测序有兴趣的科技发烧友敞开了怀抱。


或许某一天,你也可以想测量体温一样,用便携式测序仪检测自己测量流感的病原;或许孩子们可以带着便携式测序仪去夏令营,给自己喜欢的植物测序。也许未来,测序仪将与手机连接,甚至能够通过手机APP进行数据分析。


便携式概念给了测序仪更多的应用可能,或许这样的设备真正能够让基因测序变得日常可见。当然,要实现这一愿景,还需要这需要测序成本和数据分析能力跟得上需求。


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