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贺建奎现场演讲及问答全文(现身人类基因组编辑国际峰会)

动脉网 2018-11-28 20:47

编译:向莱、刘思达、何莉

编辑:郝翰、周梦亚


“基因编辑婴儿”一事持续发酵,在卫健委宣布成立专家委员会调查后,和美医疗因涉及基因编辑婴儿停牌、深圳科创委声明从未自主贺建奎基因编辑项目、科技部确认基因编辑婴儿已出生。在前两日的一片舆论和谴责声中,贺建奎没有露面、亦未作出任何正面回应。


2018年11月28日,贺建奎现身香港的第二届人类基因组编辑国际峰会。在对实验进行介绍和汇报之后,贺建奎回答了科学家和媒体的提问,动脉网对现场演讲和问答环节进行了整理:


本文只是为读者提供信息,并不代表动脉网支持或者反对文中的具体观点。


演讲内容


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首先,我必须道歉。这一消息出人意料地泄露了出去,这个消息在一个科学场所发表演讲之前就从学界内被传出去了,而且没有经过这次会议之前的同行审查程序。(被拍照打断)

 

这项研究已提交给一本科学杂志进行审查了。我还要感谢几个月前我们接触过的美联社,感谢他们从许多角度准确报道这些研究。我也感谢我的大学,虽然他们对这些研究毫不知情。感谢您分享与我的智慧,以及学界对这些数据的讨论和提供的这个论坛。

 

我将阐述我们的数据,并将重点放在人和猴子上。

 

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艾滋预防


人类在艾滋病预防治疗方面取得了可喜的进展,但是新感染人数仍然是联合国目标的三倍。在一些国家,特别是发展中国家,艾滋病毒仍然是导致死亡的十大原因之一。对于艾滋病毒阳性母亲所生的未受感染的儿童(在南非的新生儿中占很大比例),在出生后最初几个月感染艾滋病毒的风险比其他婴儿高出许多许多倍。这是一个严重的问题。这种情况往往使感染的严重程度更加严重。

 

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天然的CCR5突变对HIV1具有很强的抵抗性


在一些欧洲国家,多达10%的人口携带了一种天然的抗艾滋病毒能力,它可以防止HIV感染。CCR5基因是被研究最多的变异基因之一,也是最广为人知的基因之一。

 

1
小鼠CCR5基因敲除的研究


我们首先在小鼠体内进行CCR5基因敲除,以研究“跨代效应”( multi-generation effect)。我们获得了第三代CCR5缺失小鼠,并且通过Western blot和流式细胞术证实敲除成功。这些小鼠心、肝、肺、胃组织病理正常,小鼠一般行为评价也无差异。

 

2
人类CCR5-sgRNA设计


然后我们开始评估sgRNA是否可以设计用于人类的CCR5。我们评估了∆32变体起始的位点有可能的靶向RNA。我们的发现表明不会发生脱靶效应。以前的一些论文也评估了类似的sg4位点,也没有检测出脱靶效应。

 

 

3
猴子试验

 

sg4诱导了人类细胞系、人类胚胎中最有效的基因编辑活动。由于这个靶点在猴子基因组中是保守的,我们可以用食蟹猴(M. fascicularis)来进一步评估这个靶点。

 

早期显微注射能有效的提高效率

 

我们发现在受精后立即注射Cas9是效率最高的,这与其他研究的结果相同。多次重复实验结果相同,这同时还减少了嵌合情况。

 

单细胞测序技术

 

为了更仔细地观察镶嵌现象,我们还对几个胚胎中的每个细胞进行了测序。这些胚胎是处在1 、2 、3-细胞阶段。

 

通过二次注射提高Cas9效率

 

由于Cas9降解快且需要时间找到正确的靶点,我们探索了一些策略,通过在2-细胞阶段再次注射Cas9来减少嵌合。

 

我们扩大了样本量,并在双亲中跨周期观察到相同的实验结果。

 

4
用于人类胚胎的实验方法


然后我们想看看这个实验计划是否可以被用于成人类胚胎。正如其他人所报告的,Cas9是最有效的传递形式。调整剂量也能提高效果。根据我在2017年2月早些时候在基因组编辑研讨会上提出的建议,我们编辑了不可存活的胚胎并建立了胚胎干细胞系。

 

结果分析是正常的,核型正常。经染色和流式细胞仪检测,胚胎干细胞标志物表达正常。这种胚胎干细胞也形成了所有三种胚层,这是安全的标志。

 

5
脱靶效应检测


另一个安全问题是脱靶效应的影响。胚胎是位于生命的单个或少数细胞阶段,任何脱靶效应都会造成非常严重的后果,并有可能扩展到全身。在成人基因治疗中,脱靶效应是可以预期的,但也存在问题。在胚胎植入前,我们通过对胚胎进行单细胞全基因组测序来检测其脱靶效应。我们使用了一种放大的方法来最小化假阳性率,以获得真实的结果。其他实验室也采用了同样的方法,但我们更进一步,对亲本基因组进行测序,寻找存在于亲本细胞但不在测序基因组中的危险位点。

 

我们添加了基因组位点,以便对潜在传递位点进行无偏倚评估。我们对CRISPR设计进行了计算机预测,用于错配引导的计算设计。

 

最后,我们导入亲本基因组,这提高了灵敏度,并允许我们检测每个胚胎特有的新风险位点,这些位点来自SNPs。

 

我们能够可视化个体化的脱靶效应热点池,每个胚胎大约有1万个位点。我们使用全基因组测序来评估这些位点,并通过单细胞测序验证任何的新发现。

 

在全基因组无偏倚法鉴定的潜在切割位点中,全基因组测序数据未见明显的切割位点。使用我们的CRISPR设计软件,在50个人类胚胎中任何一个可能的危险部位都没有观察到切割活性。

 

6
hESC细胞系脱靶效应评估


我们研究了hESC细胞系的脱靶效应。我们没有亲代供体基因组,但我们能够识别出一个潜在的脱靶位点。这个脱靶位点处在非基因区域,虽然我们不能确定这是遗传还是编辑造成的。

 

在这里,可以看到19个存活胚胎的编辑效率。我们对胚胎进行了PGD和全基因组测序。没有识别出脱靶位点。


在一个胚胎中,我们在目标位点发现了6kb碱基的缺失,除了CCR5,其他基因没有受到影响。CCR5基因于其他基因之间的距离可以防止基因缺失的风险,这些检测通过下一代测序技术来实现。

 

7
植入胚胎


 

现在我主要讲双胞胎的怀孕问题。我们对双亲进行了测序来检测脱靶效应。母亲呈HIV阴性;父亲是艾滋病毒呈阳性,携带无法检测到的HIV病毒量。精子需要清洗以防其传播。我们在怀孕期间进行了DNA取样,露露和娜娜正常健康。

 

出生后,我们对几种不同的组织进行了测序。植入前遗传学检测显示有两个基因位点被编辑。一种是移码突变,它可以缩短CCR5蛋白,类似于自然保护变异。

 

我们告知了这对夫妇这意味着什么,提醒他们可以选择不经植入子宫就中断试验,或者选择胚胎。这对夫妇选择植入这个胚胎并开始双胚胎怀孕。


8
后续检测


除了桑格测序以外,我们还向志愿者报告了全基因组测序的数据,覆盖了80%的基因。全基因组测序测序的时候发现了一个脱靶效应。在胚胎植入前,我们告知了志愿者有脱靶的风险。但血液检测是并没有发现脱靶效应。

 

婴儿出生后我们对脐带血(主要是胎儿的血液)进行深度测序,通过植入前基因诊断确定了基因编辑的结果,Sanger测序的结果同样一致。

 

深度测序和Sanger测序都没有检测到脱靶效应。随后我们进行了全基因组测序,其中脐带血的测序深度为100X、其他组织为30X。这个过程中没有发现脱靶效应,在全基因组测序过程中也没有发现大的缺失。

 

接下来,我们想继续进行评估,包括通过血液检测判断HIV感染的可能性,同时还将进一步研究嵌合组织中的脱靶效应。

 

我们计划对双胞胎进行为期18年的检测,希望他们在成年后能继续配合我们的试验。谢谢!


问答环节
1
关于试验前

 

问:你对其他胚胎做了什么,它们也被移植了吗?


答:有7对夫妇参与试验,但鉴于目前的情况,临床试验暂停了。


问:你在临床试验设计中得到了什么反馈,团队规模有多大,是否获得了批准?


答:最早我和几位科学家、一名医生进行了交谈,来了解CCR5是否是一个可行的位点。后来我得到了一些数据,这些数据我在2017年的冷泉港和伯克利基因组编辑会议上进行了展示。在这个会议上,我也和其他人进行了交谈,得到了积极的反馈,以及一些批评和建设性意见。


除了科学家,我也和来自哈佛大学、斯坦福大学等美国的一些顶尖的伦理学家进行了交谈,并向来访的科学家展示了我的数据。

 

在开始临床实验室,我们起草了一份知情同意书,随后,一切按原计划进行。

 

问:知情同意书有多少人参与,并且认为是合理的?


答:4个人。


问:这份同意书是个人或者团队拟定的,还是与患者有交流?


答:团队先跟志愿者交流了2个小时。一个月后,志愿者来到深圳,我亲自带他们去见了另一位教授,并介绍了这次试验。

 

问:你有直接参与吗?


答:有,我也向他们介绍了脱靶效应、以及其他信息。

 

问:这对志愿者是怎么招募的?招募条件是什么?


答:是通过一个艾滋病志愿者组织。


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现场排队提问的科学家和媒体

2
关于伦理


问:我并不认为这项试验背后有未满足的医学需求。父亲虽然是携带者,但通过清洗依然可以避免胚胎感染。请解释下对这几名特定患者来说,存在什么为满足需求?


答:为什么说CCR5的编辑是未满足的需求?我觉得这不是给特定的患者,而是对于整个HIV感染群体的。目前我们还没有HIV疫苗。我也和一些患者谈过,有些患者的村庄里,30%的人都感染了艾滋病。事实上,我对我们的成果感到自豪。对于这个孩子,她能对HIV病毒产生免疫力。我会更加努力地工作,终身为她们负责。


问:我打断一下,目前还有其他在怀孕的母亲吗?


答:还有1名,但现在还在怀孕早期。


问:能否介绍一下,具体的伦理是怎么通过的?然后能否详细介绍下未来对于这两名孩子的治疗筛查计划?


答:你身边是否会孩子、有朋友会得严重的疾病?他们需要帮助。对于患者来说,我们拥有技术,技术得到越早的应用,就能造福更多人。


未来我会保持透明和公开,向全世界公开孩子的生理信息,大家一起决定下一步。


问:我的问题是更直接的。未来你将如何对这两名孩子负责?你会向世界公布孩子们的身份吗?如果不公布,又怎么能确认她们是否真的获得了成效?全世界都很关注她们是否健康。


答:按照规定,我们不能公布患者的具体身份。我们会把数据递交给监管部门和专家。



3
关于患者知情同意


问:如何说服志愿者?

 

答:这些志愿者都有良好的教育背景,他们对艾滋病最前沿的治疗药物和资料方法、研究都有所了解。另外,他们也通过社交平台了解艾滋病研究的最新进展。试验开始前志愿者都签署了知情同意书,他们对基因编辑技术的潜在影响和好处都有所了解。

 

问:回到透明度的问题。你是否愿意将知情同意书、手稿和试验细节在biorxiv.org或公共网站上公布

 

答:是的,知情同意书已经在网络上公布了,搜索我的名字就可以找到。至于手稿,在起草稿件的时候,其实还有其他4个人参与。我会征求他们的意见,在这之后可能会提交到biorxiv。

 

问:你如何跟志愿者解释风险的,他们是不是真的理解到了这背后的含义?

 

答:我们交流沟通的时间长达1小时10分钟。当时是在一间会议室里,除了那对夫妇,还有另外两名观察员。在签署知情同意书之前,他们已经拿到了打印好的复印件。

 

问:他们能读懂吗?

 

答:是的。他们受过很好的教育。从第一页到第20页,我逐字逐段的跟他们解释。在这个过程中,他们有权提出任何疑问。最后我给了他们一段时间商量,他们可以把知情同意书带回家再做决定。

 

问:团队成员是不是第一次草拟知情同意书?

 

答:知情同意书有两个版本,第一个是非正式的,是我实验室小组成员拟定的。第二个比较正式,是我们一起拟定的。起草之前,我阅读了NIH关于知情同意书的指南。

 

4
关于资金来源


问:能否解释一下这项研究的资金来源?

 

答:开始这个项目的时候,我还是一所大学的教授,也就是三年前。最早的资金来源是我在大学里的工资,病人的医疗支出由我自己来承担。另外一部分测序所产生的费用则由大学创业基金支付。

 

问:所以没有来自产业或公司的资金?我想说得更清楚一点,你参与了一家公司,那个公司没有参与这个项目吗?

 

答:我所在的公司既没有参与这个项目,也没有提供任何人员、空间和设备。

 

问:志愿者家庭为此付过钱吗,或者支付其中一部分?有过金钱支付的行为吗?

 

答:我们在知情同意书中表明了,我们会支付所有的医疗费用,所以不会因为这个项目向他们收取任何费用。

 

问:谁应该对这些患者负责?你们如何向他们提供医疗服务?由于受到严格的监督,你会如何评估他们的心理健康状况,疫苗接种和神经发育的结果如何?

 

答:知情同意书提供了定期血液检测和其他医疗程序的相关信息。这些都可以在知情同意书中找到。

 

5
为什么秘密进行试验


问:你提到你做了单细胞全基因组测序。据我所知,目前还没有可靠成熟的技术来进行单细胞全基因组测序。你是怎么做到的?

 

还有一个共识,无论是中国还是国际,是不允许对种系进行基因组编辑。这你为什么选择越过这条红线?,选择秘密进行这项临床试验?

 

答:我们只能从胚细胞中提取3到5个细胞进行活检。然后,我们会对单个细胞进行扩增。就目前的技术水平,可能会得到单细胞95%或者80-85%的基因组覆盖率。虽然可能会产生脱靶效应,但我们不只是看这一个胚胎,我们可以通过同时观察多个目标,来了解发生了多少脱靶效应。

 

问:为什么要这么保密?

 

答:我一直在科学界工作。我在伯克利冷泉港和一个亚洲会议上发表过演讲,向他们征求意见。那时我也就伦理问题咨询过美国的专家。

 

6
对两个孩子的未来影响


问:人们提出了许多科学问题。这两个孩子中,一个是对HIV免疫的,但另一个并不一定,他们在基因特性上是有差别的,他们是否会受到不同的对待?

 

答:我对此进行了深刻的思考。首先是尊重孩子的自主权,这些工具不应该被用来控制他们的未来,他们应该有选择的自由。第二个是鼓励孩子们发掘自己的全部潜能,追求自己的生活。

 

问:在基因被编辑前,这些孩子没有你所谓的自主权,他们的基因型可能会影响他们的成长。这会影响他们的认知或者他们的父母吗?

 

答:他们的父母知道他们是被进行过基因编辑的。

 

问:最后一个问题是,如果这是你的孩子,你会这样做吗?

 

答:如果是我的孩子,在同样的情况下,我会试一试。


备注: 现场为英文演讲,编译中可能有不准确之处。以原文内容为准。


另附贺建奎演讲PPT


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